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　　2、06.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/43(2006.01) (56)对比文件 李宏科.粘质沙雷氏菌杀虫试验. 微生物学 通报 .1982, (第2期),第56-57页二、 生物测试. 李宏科.粘质沙雷氏菌杀虫试验. 微生物学 通报 .1982, (第2期),第56-57页二、 生物测试. 冯书亮 等.一株粘质沙雷氏菌菌株的鉴定 及对黄胫小车蝗的毒力测定. 中国生物防治 .2002,第18卷(第4期),第158页摘要， 第159页 1.5菌液培养及处理. 审查员 陶冶 (54)发明名称 粘质沙雷氏菌NlM280及作为杀虫剂的应用 (57)摘要 本发明公开了一种粘质沙

　　3、雷氏菌NlM280及 作为杀虫剂的应用， 粘质沙雷氏菌NlM280发酵培 养获得的菌悬液或菌悬液离心后的上清液可应 用于褐飞虱或二化螟的防治； 对褐飞虱采用注射 和饲喂该菌菌悬液或发酵上清液的结果表明， 其 菌悬液注射对褐飞虱的致死率2天可达100， 饲 喂菌悬液3天致死率为79.8； 该菌株发酵液的 上清液在55以下处理均不影响其致病效果， 注 射发酵上清液致死率2天时可达97.2， 饲喂发 酵上清液效果滞后， 6天时致死率达84.2。 菌悬 液和发酵上清液喷施水稻后饲喂二化螟， 对二化 螟的致死率4天时可达80.0以上。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图5页 CN 104109

　　4、649 B 2016.08.24 CN 104109649 B 1.粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)NlM280， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCCNo.9131， 保藏日期为2014年5月8日， 保藏地址为 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所， 邮编100101。 2.一种权利要求1所述粘质沙雷氏菌NlM280作为褐飞虱或二化螟杀虫剂的应用。 3.如权利要求2所述的应用， 其特征在于所述粘质沙雷氏菌NlM280以发酵培养获得的 菌悬液或菌悬液离心后的上清液作为杀虫剂。 4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于

　　5、所述菌悬液菌体密度为ll08CFU/mL。 5.如权利要求3所述的应用， 其特征在于粘质沙雷氏菌NlM280菌悬液按如下步骤制备： (1)斜面培养： 将粘质沙雷氏菌NlM280接种至LB固体培养基上， 28恒温24h， 获得斜面 菌体； LB固体培养基终浓度组成： NaCl10g/L、 酵母提取物5g/L、 蛋白胨10g/L、 15g/L琼脂， pH7.2， 溶剂为水； (2)种子培养： 从斜面菌体挑取单菌落接种于LB液体培养基， 28恒温， 200rpm振荡培 养24h， 获得种子液； LB液体培养基终浓度组成： NaCl10g/L、 酵母提取物5g/L、 蛋白胨10g/ L， pH7.2，

　　6、 溶剂为水； (3)发酵培养： 取种子液以体积浓度1的接种量接种于LB液体培养基中， 28恒温， 200rpm振荡培养至OD600值为1.0， 获得发酵培养液， 将发酵培养液用LB液体培养基调整菌体 密度制成菌悬液。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104109649 B 2 粘质沙雷氏菌NlM280及作为杀虫剂的应用 (一)技术领域 0001 本发明涉及一株对水稻害虫(褐飞虱和二化螟)具有致病作用的新菌株-粘质沙雷 氏菌以及该菌在褐飞虱和二化螟防治方面的应用。 (二)背景技术 0002 水稻是我国主要粮食作物之一， 它是超过一半世界人口的主粮。 因此在粮食安全 生产中占有极其重要的地位。

　　7、然而， 水稻也是受虫害侵袭最为严重的粮食作物之一。 全国稻 区病虫害常年发生面积在1亿公顷次以上， 每年可造成稻谷损失约60万吨。 因此， 有效地控 制水稻害虫对水稻增产具有重要意义。 0003褐飞虱(Nilaparvatal gens)(Brownplanthopper)属于同翅目飞虱科， 是 我国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫， 可以直接取食或将病菌和病毒传给水稻， 从 而给粮食生产带来巨大损失。 褐飞虱具有远距离迁飞的能力和很强的适应性。 目前， 控制褐 飞虱致害性的首要方法是化学杀虫剂如吡虫啉、 噻嗪酮、 仲丁威及异丙威， 但随着吡虫啉大 范围高频次的使用， 稻飞虱对其抗药性快速提

　　8、高， 各地反映其对稻飞虱的效果大不如前。 其 次是培育抗性水稻品种， 但由于褐飞虱的强适应性， 化学农药容易导致产生抗药性种群和 飞虱的再猖獗， 抗性水稻的培育和种植虽对环境友好但也由于能克服寄主抗性的新褐飞虱 致害性种群出现， 导致其危害越来越严重。 0004 二化螟(Chilos ppressalisWalker)属鳞翅目， 螟蛾科， 是我国水稻上危害最为 严重的常发性害虫之一， 在分蘖期受害造成枯鞘、 枯心苗， 在穗期受害造成虫伤株和白穗， 一般年份减产35， 严重时减产在3成以上造成的经济损失约为115亿元， 已成为取代 稻飞虱和棉铃虫， 影响我国国计民生的头号害虫(盛承发等， 200

　　9、3)。 二化螟除危害水稻外， 还能危害茭白、 玉米、 高粱、 甘蔗、 油菜、 蚕豆、 麦类以及芦苇、 稗、 李氏禾等杂草。 目前我国防 治水稻二化螟的主要药剂为沙蚕毒素类的杀虫单， 杀虫双， 磷以及进口农药氟虫晴， 锐 劲特等化学农药。 纯生物农药也得到了逐步推广。 但由于化学农药长期大量使用， 二化螟对 其抗药性逐渐增高， 其中对沙蚕毒素类已增长了67倍， 已不能单独控制二化螟为害(汪明根 等， 2004)。 进口农药氟虫晴对二化螟防效较好但存在着防治成本高， 对水生动物不安全等 缺点。 因此， 开发选用新型高效农药新品种有效防治二化螟显得十分迫切。 0005 通过化学杀虫剂控制水稻害虫

　　10、， 不仅生产成本高， 且对生态平衡造成破坏， 对人、 畜健康危害严重， 农药残留对人类生存环境造成长期影响， 害虫也产生了抗药性。 因此挖掘 有益微生物资源， 开发新型微生物杀虫剂将成为农药产业的主体。 目前主要的微生物杀虫 剂包括有细菌杀虫剂、 病毒杀虫剂和真菌杀虫剂。 细菌杀虫剂其作用机制是胃毒作用， 昆虫 摄入病原细菌制剂后， 通过肠细胞吸收， 进入体腔和血液， 使之得败血症导致全身中毒死 亡。 目前筛选的杀虫细菌大约有100多种， 其中被开发成产品投入实际应用的主要有4种， 即 苏云金芽孢杆菌(Bacillsthringiensis ,Bt)、 日本金龟子芽孢杆菌(Bacills po

　　11、pilliae)、 球形芽孢杆菌(Bacill ssphaeric sMeyerandNeide)和缓病芽孢杆菌 (Bacill sLentimorb s)。 其中苏云金芽孢杆菌是商业开发最成功的杀虫剂)。 这些杀虫剂 说明书 1/6 页 3 CN 104109649 B 3 在生产实践中均不同程度的存在局限性如杀虫谱窄、 稳定性差， 易产生抗药性等。 因此急需 挖掘微生物资源， 寻找新的杀虫谱广， 性能稳定的微生物杀虫剂， 并通过基因工程等手段对 其进行有目的的改进， 从而能更好地发挥生物防治的综合效益。 0006 粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)属于肠杆菌科， 革兰氏阴

　　12、性菌杆状菌。 可产 生红色或紫素。 是一类普遍存在于自然界的浮生小杆菌， 可从土壤、 水， 牛奶、 面包中分 离出来， 室内饲养的昆虫易于感染该菌。 目前已报道从健康的， 死的昆虫都可分离出粘质沙 雷氏菌， 该菌可侵染昆虫6个目(直翅目， 鞘翅目， 膜翅目， 鳞翅目和双翅目等)之多， 是室内 饲养昆虫最易感染的一种病原菌之一。 小量的消化道感染通常不会造成昆虫发病， 但一旦 进入血淋巴在1-3天之内大量繁殖即可造成昆虫死亡(Sikorowski， 2001)。 该菌引起昆虫致 死率受到昆虫的种类、 昆虫发育的龄期以及其他环境因素等的影响(Steinha s1958)。 粘质 沙雷氏菌杀虫的

　　13、机制包括其分泌的蛋白酶、 脂酶、 几丁质酶以及依赖于脂多糖和鞭毛诱导 的寄主免疫细胞的程序性死亡等(Lysenko,1976； Kaska,etal1976； Hinesetal， 1988； Givskovetal1997； Ishiietal， 2012)。 目前尚无从水稻害虫中分离出粘质沙雷氏菌以 及对水稻害虫褐飞虱和二化螟具有致病作用的病原性细菌资源的分离和致病机制的研究 报道。 (三)发明内容 0007 本发明目的是从水稻褐飞虱中分离出致病细菌， 研究其致病性， 为细菌杀虫剂的 研究开发提供了新的菌株来源。 0008 本发明采用的技术方案是： 0009 本发明提供一株新菌株-粘质沙雷

　　14、氏菌(Serratiamarcescens)NlM280， 保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCCNo.9131， 保藏日期为 2014年5月8日， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所， 邮 编100101。 0010 本发明还提供一种所述粘质沙雷氏菌NlM280作为杀虫剂的应用。 0011 进一步， 所述粘质沙雷氏菌NlM280以发酵培养获得的菌悬液或菌悬液离心后的上 清液作为杀虫剂， 优选菌体密度为ll08CFU/mL的菌悬液。 0012 进一步， 所述粘质沙雷氏菌NlM280作为褐飞虱或二化螟杀虫剂的应用。 0013 更

　　15、进一步， 粘质沙雷氏菌NlM280菌悬液按如下步骤制备： 0014 (1)斜面培养： 将粘质沙雷氏菌NlM280接种至LB固体培养基上， 28恒温24h， 获得 斜面菌体； LB固体培养基终浓度组成： NaCl10g/L、 酵母提取物5g/L、 蛋白胨10g/L、 15g/L琼 脂， pH7.2， 溶剂为水； 0015 (2)种子培养： 从斜面菌体挑取单菌落接种于LB液体培养基， 28恒温， 200rpm振 荡培养24h， 获得种子液； LB液体培养基终浓度组成： NaCl10g/L、 酵母提取物5g/L、 蛋白胨 10g/L， pH7.2， 溶剂为水； 0016 (3)发酵培养： 取种子液以

　　16、体积浓度1的接种量接种于LB液体培养基中扩大培 养， 28恒温， 200rpm振荡培养至OD600值为1.0， 获得发酵培养液， 将发酵培养液用LB液体 培养基调整菌体密度制成菌悬液(优选菌体密度为ll08CFU/mL)。 将菌悬液4， 12000rpm 离心10min， 去菌体， 取上清液即为胞外代谢物的发酵上清液。 说明书 2/6 页 4 CN 104109649 B 4 0017 利用所述菌悬液或发酵上清液注射3-4龄褐飞虱， 2天致死率达97以上， 利用含 该菌悬液的全纯人工饲料饲喂3-4龄褐飞虱， 3天死亡率达79以上， 用含发酵上清液的全 纯人工饲料饲喂3-4龄褐飞虱， 6天死亡率

　　17、达84以上。 用喷施过菌悬液或发酵上清液的水 稻叶片饲喂二化螟， 4天死亡率达80以上。 0018 与现有技术相比， 本发明的有益效果主要体现在： 本发明提供一株新菌株-粘质 沙雷氏菌NlM280， 该菌株发酵培养获得的菌悬液或菌悬液离心后的上清液可应用于褐飞虱 或二化螟的防治； 对褐飞虱采用注射和饲喂该菌菌悬液或发酵上清液的结果表明， 其菌悬 液注射对褐飞虱的致死率2天可达100， 饲喂菌悬液3天致死率为79.8。 该菌株发酵液的 上清液在55以下处理均不影响其致病效果， 注射发酵上清液致死率2天时可达97.2， 饲 喂发酵上清液效果滞后， 6天时致死率达84.2。 菌悬液和发酵上清液喷施水

　　18、稻后饲喂二化 螟， 对二化螟的致死率4天时可达80.0以上。 该菌株的分离开拓了抗虫微生物资源， 为进 一步抗虫物质的分离鉴定提供了材料， 在生产实践中具有潜在的应用价值。 (四)附图说明 0019 图1为菌株NlM280在LB平板上的生长情况。 0020 图2为菌株NlM280的16SrDNA序列PCR扩增电泳图， 泳道1-5分别为挑取的5个单菌 落16SrDNA扩增的结果， 泳道M为Marker100bpDNAladder。 0021 图3为菌株NlM280与其他肠杆菌科细菌16SrDNA序列系统发育树。 0022 图4为褐飞虱微量注射位置示意图(箭头所示)。 0023 图5为实施例3中褐

　　19、飞虱感染粘质沙雷氏菌菌株NlM280(注射菌悬液)后的发病症 状。 其中A为超景深显微镜放大100倍的照片， B为普通照相机拍摄。 0024 图6为注射和饲喂NlM280菌悬液(ll08CFU/mL)对褐飞虱致病性柱形图。 0025 图7为NlM280发酵上清液不同温度处理后注射褐飞虱， 褐飞虱发病率柱形图， CK为 对照。 0026 图8为注射和饲喂菌株NlM280发酵液上清液对褐飞虱致病性柱形图。 0027 图9为NlM280菌悬液和发酵上清液对二化螟的致病性柱形图， CK为对照。 (五)具体实施方式 0028 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此：

　　20、 0029 实施例1、 菌株NlM280的筛选、 鉴定和保存 0030 (1)菌株的筛选 0031 将中国水稻研究所富阳实验室内饲养的褐飞虱种群Mudgo的褐飞虱自然发病虫体 (虫体体色全红)用体积浓度75的乙醇水溶液表面消毒5min后， 研磨虫体成粉末， 然后用 无菌水进行梯度稀释(具体稀释梯度为10倍， 100倍， 1000倍)， 取1000倍稀释度的稀释液涂 板于LB固体培养基上， 28培养12h， 获得单菌落， 挑取红色单菌落记为菌株NlM280。 0032 (2)菌株的鉴定 0033 菌株的生理生化特征为： 0034 将菌株NlM280涂板于LB固体培养基上， 28恒温24h活化，

　　21、菌株NlM280平板生长见 说明书 3/6 页 5 CN 104109649 B 5 图1。 菌株的菌落基本上是凸起， 中心不透明， 边缘不规则， 大小为12.5mm， 均产生红 素。 LB固体培养基上3743培养， 菌株为白色。 0035 挑取5个单菌落NlM280分别接种于3mL的LB液体培养基中， 28、 200rpm培养12h， 取培养OD600值为1.0左右的新鲜菌液， 1000rpm离心10min， 收集湿菌体。 按褐飞虱基因组的 提取方法分别提取湿菌体基因组DNA并进行16SrRNA的PCR扩增(参考： 王渭霞,罗举,赖凤 香,傅强.水稻褐飞虱内生共生细菌Arsenophon

　　25、： 从斜面菌体挑取单菌落接种于3mLLB液体培养基， 28恒温， 200rpm振荡培养24h， 获得种子液。 0044 (3)发酵培养： 取500 L种子液接种于50mLLB液体培养基中扩大培养， 28恒温， 200rpm振荡培养8h， 测定菌体OD600值到1.0时， 获得发酵培养液， 将发酵培养液用LB培养基 调整菌体密度为ll08CFU/mL， 制成菌悬液。 0045 实施例3： 粘质沙雷氏菌NlM280的菌悬液对褐飞虱的致病性 0046 (1)、 注射法检测菌株的致病力： 0047 选取3-4龄褐飞虱若虫， 利用eppendorf显微注射仪(型号TransferManNK2， 厂家 上

　　26、海艾本德公司)， 每个褐飞虱注射0.1 L实施例2方法制备的菌悬液， 注射位置为褐飞虱胸 部中足基部柔软的地方， 见图4， 以注射LB液体培养基为对照， 注射后褐飞虱接种于分蘖盛 期的水稻品种(TaichungNative1)TN1上， 每个水稻单株用笼罩罩住， 每个笼罩接50头注射 后的褐飞虱。 三次重复。 将笼罩放置于带水的大水盆中， 控制室内温度在251， 湿度80 左右。 24h内剔除因注射操作造成的死虫， 记录活虫数， 48h统计褐飞虱死亡率。 褐飞虱病虫 说明书 4/6 页 6 CN 104109649 B 6 症状(褐飞虱通体发红)见图5所示， 死亡率见图6所示。 结果表明菌悬液

　　28、m2.5cm的双通管作为人工饲养褐飞虱的器皿。 60.0 L人工饲料放在两端均有开口 的双通管中， 一端用两层封口膜封口(靠近饲料)， 另一端用尼龙网封口， 在将测试的50头褐 飞虱放入后用尼龙网封口。 双通管用潮湿的毛巾包裹起来保湿， 有饲料的一头对着光源。 饲 养环境条件27.00.5， 90.0湿度， 12-14小时的光照。 24h换饲料一次， 并统计活虫数。 结果见图6， 表明饲喂3天死亡率达到79.8。 0050 表1全纯人工饲料成分 0051 氨基酸类mg/100ml维生素类mg/100ml无机盐类mg/100ml 甘氨酸30生物素0.05氯化钙3.115 丙氨酸130泛酸钙5氯化

　　30、飞虱的致病性 0055 1、 发酵上清液的制备： 0056 将实施例2方法制备的ll08CFU/mL菌悬液置于50mL离心管中， 室温下12000rpm 说明书 5/6 页 7 CN 104109649 B 7 离心12min， 取上清液作为发酵上清液用于致病性检测。 发酵上清液分别经28、 55、 65 、 85和120水浴处理15min后， 进行致病性检测。 0057 2、 注射法检测菌株的致病力： 0058 选取3-4龄褐飞虱若虫， 利用eppendorf显微注射仪， 每个褐飞虱注射0.1 L的不同 温度处理15min的发酵上清液， 注射50头， 以注射LB液体培养基为对照， 注射后褐飞

　　31、虱接种 于水稻品种TN1上， 24h内剔除因注射操作造成的死虫， 记录活虫数， 48h统计褐飞虱死亡率。 室内， 三次重复。 结果见图7， 结果表明55以下处理15min不影响发酵上清液的杀虫活性， 两天褐飞虱死亡率达92.2， 高于65处理15min后杀虫效果与对照无显著差异， 对褐飞虱 的致病力丧失。 0059 3、 饲喂法检测菌株对褐飞虱的致病力： 0060 将全纯人工饲料配置为2倍的浓缩液， 选取3-4龄褐飞虱若虫， 将2倍的褐飞虱全纯 人工饲料浓缩液与28条件下培养的菌悬液发酵上清液等体积混合后， 按照实例3饲喂褐 飞虱。 24h换饲料一次， 并统计活虫数。 结果见图8， 结果表明饲

　　32、喂3天死亡率为21.2， 连续 饲喂6天死亡率可达84.2。 0061 实施例5、 粘质沙雷氏菌NlM280的菌悬液和发酵上清液对二化螟的致病性 0062 采用实施例2方法制备ll08CFU/mL菌悬液， 剪取水稻叶片约10cm， 用菌悬液喷施 水稻叶片， 叶片两端用卫生纸保湿， 接种1龄二化螟若虫20头， 将接种了二化螟的叶片放置 于15cmx3cm的离心管中， 棉塞封口。 试管放置于人工光照培养箱内261、 80湿度。 以 喷施LB液体培养基的水稻叶片为对照。 每个重复3次， 4天后统计死亡率。 0063 将实施例2方法制备的ll08CFU/mL菌悬液置于50mL离心管中， 室温12000

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